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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 3625 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Biochip-basierte Forschung entwickelt sich derzeit zu einer dreidimensionalen und groß angelegten Basis, ähnlich der In-vivo-Mikroumgebung. Für die langfristige Live- und hochauflösende Bildgebung dieser Proben wird die nichtlineare Mikroskopie, die eine markierungsfreie und mehrskalige Bildgebung ermöglicht, immer wichtiger. Die Kombination mit zerstörungsfreier Kontrastbildgebung wird nützlich sein, um Regionen von Interesse (ROI) in großen Proben effektiv zu lokalisieren und dadurch Lichtschäden zu minimieren. In dieser Studie dient eine markierungsfreie photothermische optische Kohärenzmikroskopie (OCM) als neuer Ansatz zur Lokalisierung des gewünschten ROI in biologischen Proben, die mittels Multiphotonenmikroskopie (MPM) untersucht werden. Die schwache photothermische Störung in der Probe durch den MPM-Laser mit reduzierter Leistung wurde an den endogenen photothermischen Partikeln im ROI mithilfe des hochempfindlichen phasendifferenzierten photothermischen (PD-PT) OCM nachgewiesen. Durch Überwachung der zeitlichen Änderung des photothermischen Antwortsignals des PD-PT-OCM konnte der innerhalb der vom MPM-Laser fokussierten Probe erzeugte Hotspot auf dem ROI lokalisiert werden. In Kombination mit der automatisierten Probenbewegung in der x-y-Achse konnte die Brennebene des MPM effektiv zum gewünschten Teil einer volumetrischen Probe für eine hochauflösende gezielte MPM-Bildgebung navigiert werden. Wir haben die Machbarkeit der vorgeschlagenen Methode in der Mikroskopie der zweiten harmonischen Generation anhand von zwei Phantomproben und einer biologischen Probe, einem auf einem Objektträger fixierten Insekt mit den Abmessungen 4 mm Breite, 4 mm Länge und 1 mm Dicke, demonstriert.

Die Multiphotonenmikroskopie (MPM) ermöglicht hochauflösende Analysen in verschiedenen biologischen Forschungsbereichen. In den letzten Jahren hat der Einsatz von MPM in der biomedizinischen Bildgebung immer mehr an Bedeutung gewonnen, insbesondere in den Bereichen der In-vivo- und Live-Bildgebung tiefer Neuronen bei Kleintieren1,2,3,4,5 sowie der Früherkennung von Tumoren und deren Charakterisierung6,7. 8,9, Gefäßnetzwerk- und Organoid-Bildgebung in seiner Mikroumgebung in Biochips10,11,12. Es gab viele Ansätze, die Bildtiefe zu erhöhen, das Sichtfeld (FOV) zu vergrößern und die volumetrische Scanzeit zu verkürzen, indem neben anderen ähnlichen Modifikationen geeignete Fluorophore13, adaptive Optiken14, Mehrstrahl- und Multifokalmechanismen15,16 eingesetzt wurden im optischen Aufbau, der zu Variationen von MPM-Bildgebungssystemen geführt hat, die je nach Bildgebungsanforderungen und Anwendungsszenarien angepasst werden können 5,16,17,18,19,20,21.

Lichtschädigung und Lichtbleichung sind entscheidende Faktoren, die bei der Multiphotonenbildgebung berücksichtigt werden müssen. Bei längerer Beleuchtung in Verbindung mit hoher Laserleistung, die für die markierungsfreie Multiphotonenbildgebung erforderlich ist, gibt es einen Photomechanismus zur Gewebeschädigung, der zu einer verstärkten Fluoreszenz führt und zum Zelltod führt, der allgemein als Photoschädigung bezeichnet wird 22,23,24. Um das Auftreten von Lichtschäden in lebenden Zellen zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, dass die Bildgebungsparameter wie Spitzenintensität, Wiederholungsrate und längere Belichtungszeiten (Verweilzeiten) deutlich unter der Lichtschadensschwelle liegen24. Die meisten dieser Parameter können durch die Quell- und Erkennungssysteme gesteuert werden. Mehrere Forschungsgruppen untersuchten und schlugen verschiedene Ansätze zur Unterdrückung der Auswirkungen von Photobleichung und Photoschäden vor. Die einfachste und am weitesten verbreitete Methode besteht darin, die Gesamtbeleuchtungsleistung einer Lichtquelle zu reduzieren4,25,26. Dies verringert jedoch wiederum die Gesamtempfindlichkeit des Systems aufgrund des verringerten Signal-Rausch-Verhältnisses. Alternative Ansätze zur Abschwächung dieses Effekts umfassen eine kontrollierte Lichtbelichtungsmethode, die das der Probe ausgesetzte Licht räumlich steuert, die Verwendung eines passiven Impulsteilers, der den Beleuchtungslaserimpuls in Teilimpulse mit gleichen Energien umverteilt, und ein schnelles optisches Scannen Mechanismus, der Lichtschäden durch Steuerung der Beleuchtung und Sammlung der Emission von Proben reduziert27,28,29,30. Darüber hinaus wird bei der Lichtblattbeleuchtungsmethode nur die Brennebene des Detektionsobjektivs effektiv beleuchtet31. Obwohl diese Methoden zur Reduzierung von Photoschäden und Photobleichungseffekten nützlich sind, ist bei der Suche nach Region of Interest (ROI) in großen Proben mit kleinen FOVs und langen volumetrischen Scanzeiten eine langfristige Hochleistungsbeleuchtung erforderlich, was zu Photoschäden und Photobleichung führt.

In den letzten Jahrzehnten berichteten mehrere Forschungsgruppen über die Vorteile der Integration von MPM und optischer Kohärenztomographie (OCT) als eine einzige multimodale Bildgebungsplattform, wobei ihre Vorteile die Einschränkungen der anderen Modalitäten ausgleichen32,33,34,35. Insbesondere MPM- und OCT-Bildgebungsverfahren weisen unterschiedliche Eigenschaften hinsichtlich Auflösung, FOV, Bildtiefe und Bildgeschwindigkeit auf. MPM verwendet beispielsweise einen nichtlinearen Mechanismus, der ein eng fokussiertes Volumen des Laserstrahls in der Probe mit einem Objektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) erfordert, das hohe laterale und axiale Auflösungen, aber ein kleines FOV erzeugt. Darüber hinaus ist OCT ein lineares Bildgebungssystem, das eine größere Flexibilität bei der Auswahl der Auflösung und des Sichtfelds bietet, die zu Ihrer Anwendung passen. In Bezug auf die Bildtiefe bietet MPM typischerweise Bildtiefen von mehreren hundert Mikrometern in biologischen Proben mit hoher Streuung und Aberrationen, während OCT die höhere Durchdringungskraft von Lichtquellen im nahen Infrarot nutzt, um Bildtiefen von 1–2 mm in biologischen Proben zu erreichen . Die Erzeugung volumetrischer Bilder von Proben mithilfe eines MPM-Systems erfordert die Verwendung eines Z-Achsen-Tisches mit zweidimensionaler Abtastung in Querrichtung, um die Probe axial zu bewegen. Im Gegensatz dazu kann die OCT volumetrische Bilder nur mit Raster-x-y-Scannen erfassen, ohne die Probe axial zu bewegen. Das kombinierte MPM-OCT-System kann durch die komplementäre Nutzung der Überlegenheit jedes Systems in der Bildgebung als effektive Multiskalen-Bildgebungsplattform für biologische Untersuchungen dienen.

Seit der Einführung der OCT haben verschiedene Forschungsgruppen die unterschiedlichen funktionellen Eigenschaften der Laserquelle und des Detektionsmechanismus untersucht und genutzt, um neue Methoden im Hinblick auf bildgebende Anforderungen zu etablieren. Zu den Beispielen gehören Doppler-OCT für Strömungsmessungen in Proben36, polarisationsempfindliche OCT zur Untersuchung von Doppelbrechungseigenschaften in der Probe37,38, optische Kohärenzelastographie zur Messung der Spannung und Zugfestigkeit von Strukturen in Proben37,38 und spektroskopische OCT zur Untersuchung der Wellenlängenabhängigkeit Absorption und Streuung von Licht von Strukturen in Proben37,38 und photothermische OCT (PT-OCT) zur Analyse thermischer Fluktuationen innerhalb von Proben39,40,41. Unter diesen Technologien hat PT-OCT große Forschungsaufmerksamkeit auf sich gezogen, da es sich um die Bewertung der thermischen Fluktuationen von Proben und der daraus resultierenden Änderungen ihrer physikalischen und optischen Eigenschaften handelt. In PT-OCT-Systemen wurden Nanopartikel, auf Photothermie reagierende exogene Kontrastmittel und Absorber verwendet, um die photothermischen Effekte innerhalb der Probe zu erzeugen und zu messen42,43,44,45. Bisher waren Studien mit endogenen Kontrastmitteln anstelle externer Kontrastmittel aufgrund der mangelnden Nützlichkeit und der Schwierigkeit, schwache photothermische Reaktionssignale zu messen, begrenzt. Milner et al. schlugen eine differenzielle Phasenmessung zur tiefenaufgelösten Detektion der photothermischen Reaktion im Gewebe vor, ohne den Einsatz von externem Kontrast oder Absorbermaterial46,47. Obwohl die vorgeschlagene photothermische Reaktionsdetektionstechnik auf Proben angewendet werden kann, ohne dass Kontrastmittel oder Absorber erforderlich sind, erfordert sie mehrere dedizierte Detektionskanäle und eine schnelle optische Abtastverzögerung, um die beiden unterschiedlichen interferometrischen Pfade bei der Probenabtastung anzupassen, die durch das doppelbrechende Material eingeführt werden. Darüber hinaus beträgt die erforderliche Beleuchtungslaserleistung für biologische Proben typischerweise 80–100 mW, um die photothermische Reaktion mit einem angemessenen Signal-Rausch-Verhältnis zu messen47. Jüngste Fortschritte bei PT-OCT-Techniken haben effektive Messungen der photothermischen Reaktion mithilfe endogenen Kontrasts unter Verwendung eines einzigen Detektionskanals und mit reduzierter Laserbeleuchtungsleistung von 4–10 mW ermöglicht39,48,49,50.

Diese Studie dient als Vorläufer für die Ausrichtung eines neuen ROI-Ortungsmechanismus entlang drei Achsen innerhalb des Probenvolumens, um die gesamten Photoschäden und Photobleichungseffekte zu reduzieren und den Benutzerkomfort bei der Multiphotonen-Bildgebung volumetrischer Proben zu verbessern. Die gewünschten ROIs wurden innerhalb des gesamten beobachtbaren Tiefen- und Lateralbereichs der optischen Kohärenzmikroskopie (OCM) ausgewählt. Die Änderungen der optischen Eigenschaften der Probe aufgrund der von der MPM-Laserquelle beleuchteten photothermischen Effekte wurden an den endogenen photothermischen Partikeln innerhalb des ROI mithilfe des hochempfindlichen phasendifferenzierten photothermischen (PD-PT) OCM gemessen. Durch Überwachung der zeitlichen Änderung des photothermischen Antwortsignals des PD-PT-OCM wurde die Fokusposition des Anregungslasers (Hotspot) auf dem ROI platziert. In Kombination mit der automatisierten Probenbewegung in der x-y-Achse konnte die Brennebene des MPM effektiv zum gewünschten Teil einer volumetrischen Probe für eine hochauflösende gezielte MPM-Bildgebung navigiert werden. Die ROI-Navigation wurde mithilfe einer MPM-Laserquelle mit geringer Leistung (um einen Faktor von weniger als 10 niedriger als herkömmliche Leistung) erreicht. Die PD-PT-OCM-Führungsmethode kann für jede nichtlineare Bildgebungstechnik implementiert werden, die eine Hochleistungslaserbeleuchtung erfordert, die zu Photobleichung und Photoschädigung in Proben führt, z. B. Zweiphotonen-angeregte Fluoreszenz und kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuungsmikroskopie.

Wenn ein hochenergetischer Laserstrahl eine Probe bestrahlt, ändern sich die Innentemperatur und die optischen Eigenschaften der inneren Probenstruktur51. Bei der OCT-Bildgebungstechnik kann das erkannte Interferenzsignal im Fourier-Domänen-OCT als Gleichung ausgedrückt werden: (1) in komplexer Form:

Dabei ist z der Weglängenunterschied zwischen Referenzspiegel und Grenzfläche innerhalb der Probe. \({I}_{R}\) und \({I}_{S}\) sind die vom Referenzspiegel bzw. der Probenschnittstelle zurückreflektierten Lichtintensitäten. Der \(\Phi \left(z,t\right)\) ist der Phasenterm des Interferenzsignals, der als Integralfunktion des tiefenabhängigen Brechungsindex im Raum zu einem bestimmten Zeitpunkt dargestellt werden kann, als ausgedrückt durch Gl. (2):

Dabei ist ω die zentrale Kreisfrequenz der Lichtquelle und c die Lichtgeschwindigkeit im Vakuum. Es wird angenommen, dass sich die Probe auf der positiven Seite im Raumbereich befindet und \(n\left(z,t\right)\) den tiefen- und zeitabhängigen Brechungsindex innerhalb der Probe darstellt. Wenn innerhalb der Probe eine Temperaturänderung auftritt, ist die in der Probe optisch beobachtete thermische Reaktion eine Phasenänderung aufgrund der thermoelastischen und thermorefraktiven Effekte. Somit ist Gl. (2) kann unter Berücksichtigung der thermischen Reaktionen erweitert werden, wie in Gleichung ausgedrückt. (3) (Ref.47).

wobei dn/dT die Änderung des Brechungsindex mit der Temperatur darstellt, \(\Delta T\left(z,t\right)\) die Temperaturänderung im Probengewebe darstellt und \(\beta\) die thermische Ausdehnung ist Koeffizient47. Um die Phasenänderungen in der Probe aufgrund der thermischen Reaktion bei Beleuchtung durch die MPM-Laserquelle zu messen, wurden komplexe Interferenzsignale als digitalisierte Werte mit PD-PT OCM erhalten. Der erhaltene Phasenterm ist die akkumulierte Phase entlang der Tiefe. Daher ist zunächst eine Differenzierung erforderlich, um die akkumulierte Phase46,47,49 aufzulösen, wie durch Gleichung ausgedrückt. (4).

Dabei ist \(m\) der Tiefenindex von A-Scans und \(n\) bezeichnet die festgelegten sequentiellen Inkrementalindizes vom ersten bis zum letzten A-Scan-Signal mit dem Zeitintervall \(\Delta t\). Die Gesamtzahl N der A-Scans wurde für die gleiche seitliche Position auf der Probe ermittelt, um die Empfindlichkeit der thermischen Reaktion zu erhöhen. Es dauert eine Zeitspanne von T, die gleich \(\left(N-1\right)\) mal dem Intervall \(\Delta t\) ist. Die Anzahl der A-Scans wird als Frame bezeichnet. Aufeinanderfolgende A-Scans werden subtrahiert, um die Phasenänderung über die Zeit zu messen, wie durch Gleichung ausgedrückt. (5).

wobei \(\varphi (m,n)\) das zufällige Phasenrauschen ist, das im System innerhalb des Zeitintervalls \(\Delta t\) für den räumlichen Index m und den zeitlichen Index n erzeugt wird. In dieser Studie wurden 801 A-Scans für den Zeitraum erstellt, um 800 differenzierte A-Scans zu erhalten. Die differenzierten Phasen außerhalb des Bereichs von −π und π wurden mit −2π umwickelt, um mögliche Fehler in der Nähe der Grenzen –π und π zu vermeiden. Unter den Tiefen der A-Scans wurde eine spezifische Tiefe \(d\) von Interesse ausgewählt und 800 Differenzphasenwerte in der Tiefe erreicht. d entspricht dem Produkt von \({m}_{s}\) und \(\Delta z\), wobei \({m}_{s}\) der ausgewählte Tiefenindex und \(\Delta z\ ) ist das Tiefenintervall. Wir haben diese Differenzphasenwerte in eine effektive Phasendifferenz gemittelt, die innerhalb des Zeitraums auftrat, um zufällige Phasenfehler zu unterdrücken und so die Empfindlichkeit der thermischen Reaktionserkennung des Systems zu verbessern. Phasenrauschen resultiert hauptsächlich aus thermischen Umgebungsveränderungen und mechanischen Vibrationen im System. Die gemittelte Differenzphase \({\Delta \Phi }_{avg}(d)\) wurde dann unter Verwendung von Gl. berechnet. (6).

wobei \(\Delta ={\Delta }_{t}{\Delta }_{z}\) und \(\Delta \Phi ({m}_{s},n)\) die differentiellen Phasenwerte bei bezeichnen jeweils eine bestimmte Tiefe d im \({n}\)-ten differenzierten A-Bild-Signal. Dieser Vorgang wurde nacheinander für die gewünschte Anzahl \(Fn\) (Framenummer) wiederholt. Der Begriff Frame ist hier nicht mit der herkömmlichen Bezeichnung für B-Scan zu verwechseln, die üblicherweise in der OCT-Bildgebung verwendet wird. Die \(Fn\) sind die akkumulierten 801 A-Scans von einem einzelnen Punkt. Der Begriff „Frame“ wird hier verwendet, um die Leser dazu zu bringen, über das Zeitgefühl nachzudenken und es zu korrelieren, das benötigt wird, um ein PD-PT-OCM-Signal zu erhalten, wenn sie sich auf einen B-Scan beziehen können, um die Hochgeschwindigkeitsmessfähigkeit des zu verstehen vorgeschlagene Methode. Um die photothermische Reaktion in der Probe zu stören und die resultierende Phasenänderung mit der MPM-Laserquelle zu erzeugen, wurde ein mechanischer Verschluss in den MPM-Beleuchtungsstrahlengang eingebaut und dann ferngesteuert, um sich zu bestimmten Zeiten innerhalb der Dauer von \( Fn\), je nach Anforderung. In dieser Studie wurde für \(Fn\) ein Höchstwert von 50 verwendet, sofern nicht anders angegeben. Die Messung von 50 Bildern wird als Ablesung der photothermischen Reaktion auf die Störung bezeichnet und entspricht einem Beleuchtungszyklus. Der Verschluss wurde so eingestellt, dass er sich etwa in der Mitte jedes Beleuchtungszyklus öffnete und schloss. Dadurch sollte sichergestellt werden, dass die Probe genügend Zeit hatte, auf ihre natürliche Temperatur abzukühlen. Die Implementierung des Verschlussvorgangs für eine einzelne Messung der photothermischen Reaktion und der typischen Phasenänderung über die Zeit ist in Abb. 1 dargestellt.

Zusammenhang zwischen Bildnummer, Verschlussaktion und photothermischer Reaktion während eines Beleuchtungszyklus.

Optische endogene Absorptionsmittel wie Lipide, Wasser, Melanin und Hämoglobin usw. sind in biologischen Geweben weit verbreitet52. Nach Auswahl eines ROI innerhalb des volumetrischen OCM-Bildes wurde ein Absorptionsmittel innerhalb des ROI, das eine entsprechende photothermische Reaktion zeigte, als Beobachtungspunkt für die photothermische Reaktion ausgewählt. Je näher die Fokusposition des Anregungslichts des MPM am Beobachtungspunkt liegt, desto größer ist die photothermische Reaktion. Wir haben mehrere photothermische Reaktionen gemessen und dabei den Abstand zwischen dem Beobachtungspunkt und der Brennpunktposition des Beleuchtungsstrahls variiert, um den Punkt zu bestimmen, an dem die photothermische Reaktion maximiert war. Es ist zu beachten, dass die Brennebene des MPM-Anregungslichts auf dem ROI platziert wurde und das MPM-Bild sofort aufgenommen werden konnte, ohne umherwandern zu müssen, um den ROI zu finden. Eine schematische Darstellung des oben genannten Gesamtarbeitsablaufs ist in Abb. 2 dargestellt. In Kombination mit der automatisierten Probenbewegung in der x-y-Achse wurde die Tiefenlokalisierungssuche des ROI erweitert, um sie in drei Dimensionen zu untersuchen.

Arbeitsablauf zur photothermischen Reaktionserkennung mit dem markierungsfreien PD-PT OCM. Schrittweise bildliche Beschreibung des Prozesses zur Berechnung des photothermischen Signals mithilfe des PD-PT-OCM.

In dieser experimentellen Studie wurden zwei verschiedene Phantomproben hergestellt und verwendet, um das vorgeschlagene PD-PT-OCM-gesteuerte MPM zu demonstrieren und zu charakterisieren. Das erste war eine einfache Phantomprobe, die zur Bewertung des Konzepts und zur Analyse des erfassten photothermischen Signals verwendet wurde. Eine zusätzliche Phantomprobe mit einer mehrschichtigen Struktur wurde verwendet, um die Robustheit der Anwendbarkeit des vorgeschlagenen Systems auf eine komplexe Probe wie das Blutgefäßnetzwerk von Gewebestrukturen zu validieren. Schließlich haben wir es auf eine Insektenprobe (Ixodes dammini) mit den Abmessungen 4 × 4 × 1 mm angewendet, die in einen Objektträger eingebettet war, um die praktische Anwendbarkeit des Systems für biologische Proben zu bewerten. Detaillierte Informationen zu den verwendeten Proben finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“.

Eine einfache Phantomprobe (Ultraschallgel) wurde verwendet, um die photothermische Reaktion mit der vorgeschlagenen Methode zu charakterisieren und zu analysieren. Das Versuchsprotokoll war für alle in dieser Studie durchgeführten Experimente ähnlich (siehe Abschnitt „Materialien und Methoden“ für die Herstellung einfacher und komplexer Netzwerkphantomproben und das Versuchsprotokoll). Die photothermische Reaktion wurde wie in Abb. 3 dargestellt gemessen. Rückstreuende Partikel wie Luftblasen oder Staub, die sich im mittleren Bereich des Gelmediums befanden, wurden im OCM-Querschnittsbild als Beobachtungspunkt für die photothermische Reaktion ausgewählt. Die Fokusposition des MPM-Objektivs wurde entlang der optischen Achse des OCM nach oben verschoben, von unterhalb des Deckglases und über den Ultraschallgelbereich der Phantomprobe, wie in Abb. 3a dargestellt. Die photothermische Reaktion wurde für jede 10-µm-Bewegung des MPM-Objektivs bis zu 500 µm der gesamten Verfahrstrecke gemessen, was 50 Messwerten entspricht. Die Gesamtzeit für 51 Messungen betrug ~ 73 s. Der Zeitaufwand für das Verschieben manueller Übersetzungen wurde nicht berücksichtigt. Wie in Abb. 3b dargestellt, wird das photothermische Reaktionssignal in Abständen von 100 µm von den Gesamtmesswerten durch den gepunkteten rechteckigen Kastenbereich angezeigt. Es ist ersichtlich, dass die maximale photothermische Reaktion, die bei jeder Messung erfasst wurde, einen stetigen Anstieg bzw. Rückgang aufwies, wenn sich die Fokusposition des MPM-Objektivs dem mittleren Bereich der Probe näherte bzw. sich von diesem entfernte. Wie erwartet war die photothermische Reaktion am größten, wenn sie den mittleren Bereich des Gels durchquerte. Abbildung 3c, d sind die in Abb. 3b gezeigten vergrößerten Diagramme, die die beobachteten photothermischen Reaktionssignale anzeigen, wenn sich der Brennpunkt des MPM-Objektivs in der Nähe der Mitte des Gelbereichs befand, bzw. die detaillierten Eigenschaften der photothermischen Reaktion. Wie in Abb. 3b-d zu sehen ist, wies die erfasste photothermische Reaktion bei allen Messwerten zwei Spitzen auf, die die Phasendifferenzänderung darstellen, die der maximalen Temperaturstörung entspricht. Die Temperatur in der Probe änderte sich am schnellsten direkt nach dem Öffnen und Schließen des Verschlusses. Bei geöffnetem Verschluss wurde der MPM-Laserstrahl auf die Probe fokussiert und löste so photothermische Effekte aufgrund von Änderungen der Innentemperatur der Probe aus, die als erster Temperaturstörungsbereich (Temperaturanstieg) betrachtet wurde, wie in Abb. 3c. Als die Temperatur ihr Maximum erreichte und sich stabilisierte, kehrte die Änderung der Phasendifferenz auf einen Wert zurück, der nahe dem Wert bei der Referenztemperatur ohne Beleuchtung lag. Als sich der Verschluss schloss, begann die in der Probe gespeicherte Wärmeenergie abzunehmen. Mit anderen Worten: Wenn die Ursache des Temperaturanstiegs (MPM-Laserstrahl) nicht mehr der Probe ausgesetzt ist, sinkt die Gesamttemperatur der Probe und pendelt sich auf ihre ursprüngliche natürliche Temperatur ein. Dies kann als zweiter Temperaturstörungsbereich (Temperaturabfall) angesehen werden, wie in Abb. 3d dargestellt.

PD-PT-OCM-Signalanalyse anhand einer einfachen Phantomprobe. (a) ist die bildliche Beschreibung der MPM-Fokuspositionsbewegung über verschiedene Tiefen. (b) ist die vollständige photothermische Reaktion, die in der einfachen Phantomprobe in einem Tiefenbereich von 500 µm beobachtet wurde. (c) ist das vergrößerte Diagramm der im mittleren Bereich der Probe beobachteten photothermischen Reaktion. (d) ist die maximale photothermische Reaktion, die innerhalb der Probe beobachtet werden kann. (e) sind die maximalen mittleren Phasenwerte, aufgetragen gegen den Tiefenbereich von 500 µm in der Probe. (f) ist die Grafik, die aus der absoluten Differenz zwischen aufeinanderfolgenden Werten in (b) erstellt wurde. Abbildung (a) ist nicht maßstabsgetreu.

Um das Ausmaß der photothermischen Reaktion entsprechend der Änderung der Fokusposition der Objektivlinse weiter zu analysieren, werden die Maximalwerte der photothermischen Signale in Bezug auf verschiedene Fokuspositionen des MPM-Objektivs in der Tiefe aufgetragen, wie in Abb. 3e dargestellt. Dies ermöglicht die Visualisierung der gesamten thermischen Reaktion der Probe. Die rote gestrichelte Linie in Abb. 3e zeigt den ausgewählten Beobachtungspunkt des OCM für die photothermische Reaktion an, vorausgesetzt, dass das MPM-Objektiv über die gesamte Probentiefe verschoben wurde. Die drei Intensitätsspitzen (schwarz) sind die erkannten SHG-Signale, die jeweils der ersten Oberfläche des Deckglases, der zweiten Oberfläche des Deckglases und der ersten Oberfläche des Glasobjektträgers entsprechen. Der Beobachtungspunkt für die photothermische Reaktion fällt mit der Mitte des Gelbereichs zwischen den beiden SHG-Signalen zusammen, die die zweite Oberfläche des Deckglases und die erste Oberfläche des Glasobjektträgers darstellen. Durch die Anwendung einer Polynomanpassung fünfter Ordnung (zur Kompensation des induzierten zufälligen Phasenrauschens) auf die Kurve des photothermischen Signals wurde ein sanfter Übergangstrend der Kurve erhalten. Zusätzlich ist in Abb. 3f ein Diagramm dargestellt, das die absolute Differenz zwischen aufeinanderfolgenden Werten nach der Polynomanpassung darstellt. Dies ermöglicht eine klare Visualisierung des Zeitpunkts, an dem der Fokus des MPM-Objektivs mit dem festen Beobachtungspunkt zusammenfiel.

Um die ROI-Auswahl für die nichtlineare Bildgebung mittels PD-PT-OCM zu bewerten, wurden im Experiment großflächige mehrschichtige zusammengesetzte Phantomproben verwendet, die die Gewebestruktur von Blutgefäßen oder neuronalen Netzwerken nachahmen. Die Probe enthielt ein mehrschichtiges Linsenreinigungstuch mit einer Dicke von ca. 300 µm, das in destilliertes Wasser getaucht wurde (weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“). Es wird verwendet, um die Wirksamkeit der ROI-Auswahlmethode mithilfe der Echtzeit-Querschnitts- und En-Face-Bildgebungsfähigkeiten von OCM zu validieren, das ein breiteres Sichtfeld als das begrenzte Sichtfeld von MPM aufweist. Dies ist in Abb. 4a-c,e,f dargestellt. Abbildung 4a zeigt das volumetrische dreidimensionale (3D) OCM-Bild der Probe mit einem Sichtfeld von 3,0 × 3,5 × 0,3 mm entlang der horizontalen, vertikalen und Tiefenachse. Das 3D-Volumenbild wird durch zwei rechteckige ROI-Bereiche hervorgehoben: den anfänglichen ROI (orange) und den verschobenen ROI (blau) an gewünschten Stellen für die MPM-Bildgebung. Abbildung 4b,e zeigt die OCM-Bilder mit einem Sichtfeld von 1,0 × 1,5 mm, die in den ROI-Regionen erhalten wurden. Abbildung 4c, f zeigt vergrößerte Bilder der ROIs, die in den rechteckigen blauen und gelben Kästchenbereichen in Abb. 4b, e dargestellt sind und zum Vergleich mit SHG-Bildern verwendet wurden. Der erste Beobachtungspunkt innerhalb des anfänglichen ROI wurde in einer Tiefe von 100 μm ausgewählt, wo er sich in der Nähe des Deckglases befand. Die Fokusebene des MPM-Objektivs wurde mithilfe des ROI-Auswahlmechanismus positioniert. Die Abbildungen 4e–g wurden erhalten, nachdem die Probe in den seitlichen Richtungen von X bzw. Y auf 1000 μm und in der Tiefenrichtung zum Glasobjektträger (Z-Achse) auf 100 μm bewegt wurde. um die Navigation verschiedener ROIs zu simulieren (weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt „Materialien und Methoden“). Vor der Probenbewegung befand sich der für die MPM-Bildgebung ausgewählte Bereich der Gewebestruktur in der Nähe des Deckglases. und nach der Probenbewegung wurde der abzubildende Bereich der Gewebestrukturen näher an die erste Oberfläche des Glasobjektträgers verschoben. Abbildung 4d,g zeigt die MPM-SHG-Bilder, die vor und nach der Bewegung der Probenbühne aufgenommen wurden. Bei den SHG-Bildern handelte es sich um gestapelte Bilder mit einem Tiefenbereich von 70 µm innerhalb der dargestellten orangefarbenen und blauen rechteckigen Kästchen im volumetrischen OCM-Bild. Dies geschieht, um die MPM-En-Face-Bilder besser mit den OCM-En-Face-Bildern abzugleichen und zu korrelieren. Die Hohlkreuze in den angezeigten roten, orangen und blauen Bereichen korrelieren mit übereinstimmenden Positionen in den jeweiligen OCM- und MPM-En-Face-Bildern.

Bewertung der Robustheit des PD-PT-OCM-gesteuerten MPM mit einer komplexen Netzwerk-Phantomprobe. (a) ist das volumetrische 3D-OCM-Bild der Probe. (b, c, e, f) sind OCM-En-Face-Bilder der komplexen Netzwerk-Phantomprobe. (c, f) sind die vergrößerten Bereiche, die in (b) bzw. (e) durch gestrichelte Quadrate gekennzeichnet sind. (d, g) sind die gestapelten SHG-En-Face-Bilder desselben Ortes, die in (c) und (f) gescannt wurden. Darüber hinaus geben in (a) die rechteckigen Kästchen in Orange und Blau den Stapeltiefenbereich für SHG-Bilder an den ursprünglichen bzw. verschobenen ROIs an den gewünschten Stellen an.

Um die Nützlichkeit der PD-PT-OCM-Führung für ROIs in einer großvolumigen biologischen Probe für die MPM-Bildgebung zu validieren, wurde eine biologische Probe (weibliches Ixodes dammini) verwendet, die in einen Objektträger eingebettet war. Vor der photothermischen Bildgebung wurde die Probe mit dem maximalen Sichtfeld des OCM abgebildet und mit einer Volumen-Rendering-Software nachbearbeitet. Ein volumengerendertes OCM-3D-Bild ist in Abb. 5a dargestellt, und ein En-Face-Bild des Volumenbilds in einer Tiefe von 65 µm ist in Abb. 5b dargestellt. Unter Verwendung der Echtzeit-Querschnitts- und En-Face-OCM-Bilder wurden mehrere verschiedene Abschnitte der biologischen Probe mithilfe des ROI-Auswahlmechanismus basierend auf der Messung der photothermischen Reaktion mit dem PD-PT-OCM gezielt ausgewählt. Für die ROI-Auswahl wird eine Gesamtfläche von 4 × 4 mm (vertikal × horizontal) verwendet. Insbesondere wurden vier Regionen ausgewählt und angepeilt, die sich an der obersten Oberfläche des Scutum/Schildes, am oberen Rand des linken Pedipalpus, an der Spitze des Hypostoms und am oberen Rand des rechten Pedipalpus befanden. Unter diesen Teilen wurden das Hypostom sowie der linke und rechte Rand der Palpen ausgewählt, da diese Teile der Zecken für Untersuchungen von Lebensräumen zur Nahrungsaufnahme von Zecken im Zusammenhang mit der Lyme-Borreliose nützlicher sind53 und das Scutum den oberen Teil der Rückenoberfläche bedeckt. Fast alle Körperteile der Probe boten ein gut beobachtbares PD-PT-OCM-Signal, und es ist bemerkenswert, dass die photothermische Signalreaktion mit zunehmender Dicke abnimmt. Dies kann auf die Zusammensetzung sowie die optischen und thermischen Eigenschaften der Probe zurückzuführen sein. Die SHG-Bilder der Zielregionen sind jeweils in Abb. 5c-f dargestellt. Die Gesamtwerte der beobachteten photothermischen Reaktionen im Hypostombereich gemäß den tiefenvariierenden MPM-Objektivfokuspositionen sind in der in Abb. 5g dargestellten Grafik dargestellt. Der hier verwendete Schrittabstand zwischen zwei Tiefenpositionen beträgt 20 µm. Insgesamt wurden 11 Messwerte verwendet, um die gesamte Hypostomregion abzudecken. Wie aus dem Diagramm einer repräsentativen photothermischen Reaktion (siehe Abb. 5h) hervorgeht, waren die erfassten maximalen phasendifferenzierten Peaks nicht umgekehrt proportional. Dies kann auf die thermoelastische Ausdehnung der biologischen Strukturen der Probe zurückgeführt werden.

Überprüfung der Anwendbarkeit des vorgeschlagenen PD-PT-OCM-gesteuerten MPM für eine biologische Probe. (a, b) sind das jeweilige OCM-Volumen-gerenderte Bild und das En-Face-Bild der Insektenprobe. Die Abbildungen (c bis f) sind die MPM-En-Face-Bilder verschiedener Regionen in der Probe, die unter Verwendung der PD-PT-OCM-Anleitung erstellt wurden. (g) ist die repräsentative photothermische Reaktion, die durch unterschiedliche Tiefenposition des MPM-Objektivs im Hypostombereich der Probe beobachtet wird, und (h) ist das repräsentative Diagramm eines photothermischen PD-PT-OCM-Reaktionssignals.

Der Einsatz von MPM erfreut sich in verschiedenen biomedizinischen Bildgebungsszenarien zunehmender Beliebtheit. Eine dieser Möglichkeiten, bei denen MPM an Anwendbarkeit zugenommen hat, sind biochipbasierte Forschungsuntersuchungen. Die Biochip-basierte Forschung entwickelt sich derzeit von zweidimensionalen (2D) zu 3D-Plattformen, ähnlich der In-vivo-Mikroumgebung. Insbesondere ist es notwendig, biologische Komplexität in großem Maßstab zu etablieren, um künstliche Organe für zukünftige Arzneimitteltests oder eventuelle Organersatze zu schaffen. Um dies zu erreichen, wird derzeit an 3D-Druck und Organoid-basierten Selbstorganisationsmethoden geforscht54,55. Für die langfristige Live-Bildgebung und Multiskalenanalyse von großformatigen Proben wird die nichtlineare Mikroskopie, die eine tiefe Gewebebildgebung und markierungsfreie Bildgebung ermöglicht, immer wichtiger56,57. Bei der Durchführung nichtlinearer Mikroskopie muss darauf geachtet werden, Lichtschäden zu vermeiden. Die vorgeschlagene Methode nutzt endogene Partikel innerhalb der Probe zur ROI-Ortung in 3D in der markierungsfreien Multiphotonenbildgebung. Die vorgeschlagene Methode kann Lichtschäden minimieren, indem ein ROI genau identifiziert wird, wo eine hochauflösende 3D-molekulare Bildgebung erforderlich ist (ergänzende Informationen). Dieses Konzept ähnelt dem der Phasenkontrastmikroskopie, die üblicherweise in Fluoreszenzmikroskopen verwendet wird, um Photobleichung zu minimieren. Allerdings liefern diese herkömmlichen Führungsmechanismen nur ein topologisches 2D-Bild der Probe. OCT kann als Modalität für die geführte Bildgebung von großflächigen, nicht transparenten und dicken biologischen Geweben in 3D verwendet werden, ebenso wie die Phasenkontrastmikroskopie, die als Hilfsmittel für die geführte Bildgebung transparenter Proben verwendet wird.

In der aktuellen Studie haben wir die photothermische Reaktionskurve erhalten, indem wir den Brennpunkt des MPM-Objektivs manuell geändert haben, das in Richtung des Beobachtungspunkts (OCM-Objektiv) bewegt wurde. Die photothermische Reaktionskurve hat die Form einer unimodalen Funktion mit einem Maximalwert im Messbereich. Künftig durch die Integration einer bewährten effizienten Suchmethode wie der Suche nach dem Goldenen Schnitt58, der Fibonacci-Suche59 oder der Kurvenanpassungssuche60 (mit einem automatisierten Axialfokusmotor mit Objektivlinse) anstelle einer linearen Suche mit 50 Versuchen in Intervallen von 10 µm; Der gewünschte Punkt kann mit der gleichen Genauigkeit in weniger als 10 Versuchen gefunden werden. Darüber hinaus kann die Suchzeit erheblich verkürzt werden, wenn der Hochgeschwindigkeits-Suchalgorithmus mit einem Hochgeschwindigkeits-Motorgerät zum axialen Scannen der Brennebene des MPM-Objektivs kombiniert wird. In dieser Studie wurden zur ROI-Ortung in einer relativ großen biologischen Probe mit Abmessungen von 4 × 4 mm (vertikal × horizontal) insgesamt 11 Messwerte mit einem Schrittintervall von 20 µm in Tiefenrichtung verwendet. Das Schrittintervall und die Gesamtmesswerte können je nach Probenzusammensetzung und -dicke adaptiv gewählt werden.

Die Fehlerwahrscheinlichkeit für die ROI-Position (in der Tiefe) für die MPM-Objektivführung hängt von der axialen Auflösung des OCM-Systems und der Phasenempfindlichkeit ab. Die axiale Auflösung des verwendeten OCM-Systems beträgt ~ 5 µm. Daher ist die Genauigkeit der MPM-Objektivführung mit der axialen Auflösung des OCM identisch. Das vorgeschlagene multimodale Bildgebungssystem ist so konfiguriert, dass OCM und MPM koaxial ausgerichtet sind und sich auf gegenüberliegenden Seiten der Probe befinden. Die demonstrierte Methode misst die absolute Position des Hotspots des MPM-Objektivs innerhalb der Probe. Selbst wenn eine Probe mit komplexen Strukturen und Probenschnittstellen verwendet wird, unterliegt die Leistung der PD-PT-OCM-Detektion daher keinen fehlerhaften Messungen. Das Sichtfeld des PD-PT-OCM-Systems kann je nach Bildgebungsanforderungen adaptiv geändert werden, indem die Objektivlinsen im Proben- und Referenzarmaufbau geändert werden. Allerdings stehen das Sichtfeld und die laterale Auflösung in einem umgekehrten Verhältnis zueinander. Im Allgemeinen haben Objektive mit größerem Sichtfeld eine geringere laterale Auflösung und umgekehrt. Die Fähigkeit der OCM zur tiefenaufgelösten Bildgebung nimmt bei dicken Proben ab. Dies ist auf die eingeschränkte Lichtdurchdringung in dickem Gewebe zurückzuführen. Auch in dicken Proben mit dicht gepackten komplexen Strukturen nehmen die nachweisbaren, durch Multiphotonen erzeugten Signale in tieferen Geweben ab. Somit wird die durch den MPM-Hotspot erzeugte Wärme auch in tieferen Geweben abgebaut. Die Verwendbarkeit der vorgeschlagenen Methoden zur ROI-Auswahl mithilfe von OCM ist nicht nur durch die hier angegebene Dicke der Phantomprobe eingeschränkt. Die ROI-Auswahl innerhalb der Probe ist über den gesamten optischen Tiefenbereich von OCM möglich und hängt nur von der Probenzusammensetzung und der für das OCM-System verwendeten Optik ab. Das in der Probe erzeugte photothermische Signal kann effektiv über den gesamten beobachtbaren Tiefenbereich des PD-PT-OCM erfasst werden. Die photothermische Signalableitung und die Verschlechterung der Nachweiseffizienz hängen von der Probendicke, der Zusammensetzung sowie ihren optischen und thermischen Eigenschaften ab51.

Herkömmlicherweise wird die photothermische OCT-Bildgebung verwendet, um Blutgefäße mithilfe des photothermischen Effekts von Blutzellen, bei denen es sich um endogene Substanzen handelt, abzubilden oder um die Position und Hotspots von exogenen photoreaktiven Partikeln wie Polymeren und Goldnanostäben in lebenden Geweben zu messen. Das hochempfindliche PD-PT-OCM kann auch verwendet werden, wenn endogene oder exogene Faktoren im sichtbaren Bereich des OCM-Bildes vorhanden sind. Mit der vorgeschlagenen Methode können wir die Anregungsbeleuchtung für die photothermische Therapie mit exogenen Substanzen gezielt und lokal auf den gewünschten Ort beschränken und so eine unnötige Erwärmung normaler Gewebe vermeiden.

Zusammenfassend dient dieses Papier als vorläufiger Bericht, um die potenzielle Verwendbarkeit des Einsatzes von PD-PT OCM als Leitwerkzeug für die nichtlineare Mikroskopie zur effektiven und genauen Navigation von ROIs in großvolumigen Proben darzustellen. Die ROIs wurden unter Nutzung des großen Sichtfelds und des beobachtbaren Tiefenbereichs in En-Face- und Querschnitts-OCM-Bildern ausgewählt. Um eine gezielte MPM-Bildgebung innerhalb der ROIs in 3D zu erreichen, wurden Hotspots innerhalb der Probe, die mit dem MPM-Laser bei schwacher Leistung fokussiert wurden, mithilfe des hochempfindlichen PD-PT-OCM erfasst. Anschließend fokussierten wir den MPM-Laser auf einen Beobachtungspunkt, der aus den endogenen Absorptionsmitteln im ROI ausgewählt wurde. Mit dem PD-PT OCM kann die Fokusposition des MPM-Objektivs auf dem ROI innerhalb des beobachtbaren Tiefenbereichs des OCM-Querschnittsbilds platziert werden. Durch das effektive Auffinden und Anvisieren von ROIs, die eine hochauflösende MPM-Bildgebung erfordern, kann die Gesamtbelichtungszeit von Hochleistungslasern verkürzt werden, insbesondere bei großen Proben, wodurch Photobleichung und Photoschäden deutlich gemindert werden. Das hochempfindliche PD-PT-OCM-System bietet potenzielle Anwendungen für die photothermische Reaktionsanalyse, da es sogar Temperaturänderungen aufgrund schwacher photothermischer Störungen in dreidimensionalen biologischen Proben in Echtzeit erkennen kann. Darüber hinaus ist anzumerken, dass der Nutzen der vorgeschlagenen PD-PT-OCM-basierten Führungsmethode für jede nichtlineare Bildgebungstechnik implementiert werden kann, die eine Hochleistungslaserbeleuchtung erfordert (die zu Photobleichung und Photoschädigung in Proben führen kann), wie z. B. zwei -photonenangeregte Fluoreszenz und kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuungsmikroskopie. Dies reduziert die Gesamterfassungszeit, die für die ROI-Position in nichtlinearen Bildgebungssystemen erforderlich ist.

Die Gesamtkonfiguration des multimodalen Bildgebungssystems ist in Abb. 6 dargestellt. Die multimodale Bildgebungsplattform verfügte über zwei unabhängige Lichtquellen. Das OCM-System wurde von einer superlumineszierenden Breitbandlichtquelle (SLD-37-HP3, Superlum Diodes Ltd., Carrigtwohill, Irland) mit einer maximalen Ausgangsleistung von 18 mW bei 840 nm betrieben. Der Ausgang der Quelle wurde direkt mit dem Eingangsanschluss eines optischen Zirkulators (850-H7-L-15-FA, OF-LINK Communications Co., Ltd. Shenzhen China) verbunden. Der Ausgangsanschluss des Zirkulators war mit einem Dublettkollimator (F240APC-850, Thorlabs, Inc., NJ, USA) mit einer Strahlgröße von 2,4 mm verbunden. Der kollimierte Strahl wurde mit einem zweiachsigen Galvanometer-Scanspiegel (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) entlang der horizontalen und vertikalen Achsen rasterabgetastet. Anschließend wurde der Scanstrahl auf eine Kombination aus Scan- und Tubuslinsen mit Brennweiten von 54 mm (LSM04-BB, Thorlabs, Inc., NJ, USA) und 200 mm (TTL200-B, Thorlabs, Inc., NJ, USA) gerichtet. USA). Mit dieser Konfiguration wurde die optische Strahlgröße (vom Kollimator) um den Faktor 3,7 vergrößert. Der vergrößerte Strahl wurde dann durch einen rechteckigen Strahlteiler (BSW11, Thorlabs, Inc., NJ, USA) im Verhältnis 50:50 geteilt. Die geteilten Strahlen wurden auf den Referenzarm und den Probenarmaufbau gerichtet. Der Strahl in Richtung Referenzpfad durchlief eine Kombination optischer Systeme wie einen kontinuierlich variablen Abschwächer (NDC-50C-4 M, Thorlabs, Inc., NJ, USA) und eine 4-fach-Objektivlinse (UPlanFL N 4.0x, Olympus, Tokio, Japan) mit einer Brennweite von 45 mm, gefolgt von einem hochreflektierenden Breitbandspiegel (PF10-03-P01P, Thorlabs, Inc., NJ, USA). In ähnlicher Weise wurde im Probenpfad der einfallende geteilte Strahl auf eine Objektivlinse gerichtet, die den Spezifikationen der im Referenzpfad verwendeten Objektivlinse entsprach. Der von der Probenoberfläche zurückreflektierte Laserstrahl interferierte mit dem zurückreflektierten Referenzstrahl im Strahlteiler. Das rückgestreute Interferenzsignal wurde über einen Zirkulator zu einem Spektrometer geleitet, das eine Zeilenkamera (Sprint spl4096-140k, Basler AG, Ahrensburg, Deutschland) mit 4096 Pixeln enthielt. In der aktuellen Konfiguration deckte das Spektrum nur den mittleren Teil des Kamerasensors ab und es wurden nur 2048 Pixel in der Zeilenkamera verwendet. Die erkannten Signale wurden auf einem Computer verarbeitet, um die Querschnitts- und En-Face-OCM-Bilder in Echtzeit anzuzeigen. Das gebaute OCM-System hatte eine axiale und laterale Auflösung von ~ 5 µm und ein maximales Sichtfeld von 4 × 4 × 1 mm entlang der horizontalen, vertikalen bzw. Tiefenachse. Ein Satz von 250 lateralen Positionen (A-Linie) wurde nacheinander gescannt, um ein 2D-Querschnitts-OCM-Bild zu erstellen, und 250 horizontale Positionen wurden gescannt (2D-Bilder), um einen Volumenbildsatz zu erhalten. Aus dem Volumenbildsatz wurde (je nach Bedarf) eine bestimmte Tiefe ausgewählt, um in Echtzeit ein En-Face-Bild zu erhalten. Das OCM-System hatte eine Durchschnittsgeschwindigkeit von 90 Bildern pro Sekunde.

Schematische Darstellung des multimodalen Bildgebungssystems. Schematische Darstellung des optischen Designs mit den verwendeten optischen Komponenten zusammen mit den MPM- und OCM-Quellen, den Detektionskomponenten und dem zweiachsigen Mikrometer-Translationsprobentisch. Figur nicht maßstabsgetreu gezeichnet.

Das MPM-System verfügte über eine Hochleistungs-Femtosekunden-Faserlaserquelle (ELMO HP, Menlo Systems, Inc., NJ, USA) mit einer maximalen Ausgangsleistung von 180 mW und einer Pulsbreite von < 70 fs (typischerweise 45 fs). eine Wiederholungsrate von 100 MHz. Die Laserquelle war auf 1560 nm zentriert und hatte eine spektrale Bandbreite von 30 nm. Der Laserstrahl wurde mit einem optischen Triplett-Kollimator (TC18APC-1550, Thorlabs, Inc., NJ, USA) mit einer Strahlgröße von etwa ~ 3 mm kollimiert. Die Laserleistung wurde nach Bedarf mithilfe einer Kombination optischer Abschwächer gesteuert. Der sich ausbreitende Strahl passierte dann einen elektronisch gesteuerten mechanischen Verschluss (SHB025, Thorlabs, Inc., NJ, USA). Der Computer steuerte den mechanischen Verschluss, um je nach Bedarf während einer bestimmten Betriebszeit eine optische Beleuchtung im Probenbereich zu erzielen. Der nachfolgende Laserstrahl nach dem Verschluss wurde mit einem zweiachsigen Galvanometer-Scanspiegel (GVSM002-JP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) entlang der horizontalen und vertikalen Achsen rasterabgetastet. Der Laserstrahl wurde dann durch eine Kombination aus Scanlinse (SL50-2P2, Thorlabs, Inc., NJ, USA) und Röhrenlinsen (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) mit Brennweiten von 50 mm und 200 mm geleitet , jeweils. Diese optische Kombination vergrößerte den Laserstrahl um den Faktor 4. Der kollimierte und vergrößerte Laserstrahl breitete sich durch einen dichroitischen Spiegel (FF801-Di02-25 × 36, IDEX Health & Science, LLC, New York, USA) aus. Der dichroitische Spiegel wurde in einem Neigungswinkel von 45° zum einfallenden Laserstrahl platziert. Der umgeleitete MPM-Laserstrahl wurde dann unter Verwendung einer 30-fach asphärischen Objektivlinse (5723-CH 30x, Newport Corporation, CA, USA) mit einer Brennweite von 6,2 mm auf die Probe fokussiert. Der fokussierte MPM-Laserstrahl auf der Probe erzeugte die SHG-Signale von Probenmolekülen, die von der Objektivlinse zurückgestreut und gesammelt wurden. Die rückgestreuten SHG-Signale wurden dann durch den dichroitischen Spiegel übertragen, der auf eine Tubuslinse (TTL200MP, Thorlabs, Inc., NJ, USA) mit einer Brennweite von 200 mm, Bandpassfilter (FF01-794/32-25, IDEX Health & Science, LLC, New York, USA) und achromatische Dublettlinse (AC254-050-B, Thorlabs, Inc., NJ, USA) mit einer Brennweite von 50 mm. Dieser Strahl wurde auf eine Photomultiplierröhre (H7422-50, Hamamatsu Photonics, Shizuoka, Japan) übertragen. Die elektrisch umgewandelten Signale wurden vorverstärkt und dann zur weiteren Verarbeitung an einen Computer übertragen, um die En-Face-MPM-SHG-Bilder der Probe zu erhalten. Das MPM-System hatte eine Auflösung von etwa ~ 1 µm. Mit der angegebenen optischen Konfiguration wurde ein maximales FOV von 300 × 300 µm erreicht.

Die OCM- und MPM-Bildgebungssysteme wurden von oben bzw. unten auf ein Mikroskop (OLYMPUS-IX73, Olympus, Tokio, Japan) montiert und die OCM- und MPM-Laserstrahlen wurden koaxial ausgerichtet. Die x- und y-Koordinaten des ROI für das hochauflösende MPM wurden aus dem Echtzeit-En-Face-OCM-Bild ausgewählt. Wir haben die Tiefenkoordinate des ROI aus dem korrelierten OCM-Querschnittsbild ausgewählt, das die Tiefenposition für die Beobachtung der photothermischen Reaktion darstellte. Die seitliche Ausrichtung auf den ausgewählten ROI für das MPM wurde durch die translatorische Bewegung einer Mikropositionierungsstufe (X und Y) (MCL-MOTNZ, Mad City Labs Inc., WI, USA) implementiert. Das MPM-Anregungslicht wurde dann auf die Tiefenposition des ROI fokussiert, indem die Änderungen in der photothermischen Reaktion beobachtet wurden, während die Fokusposition des MPM in Bezug auf die eingebaute axiale Bewegung des Mikroskopkörpers geändert wurde. Die translatorische Bewegung der Probe wurde mithilfe des LabVIEW-Programms automatisiert, während die axiale Bewegung manuell gesteuert wurde.

Um die Methodik und Robustheit des vorgeschlagenen multimodalen PD-PT-OCM-gesteuerten MPM-Bildgebungssystems zu bewerten und zu analysieren, wurden zwei Phantomproben hergestellt. Eine der Proben wurde hergestellt, indem ein handelsübliches Ultraschallgel auf einen 1-mm-Glasobjektträger gelegt und ein 170 ± 5 µm dickes Deckglas auf das Ultraschallgel gestapelt wurde, wie in Abb. 7a gezeigt. Hier wird Ultraschallgel verwendet, da seine thermischen Eigenschaften stabiler sind und seine Wärmeleitfähigkeit der von biologischem Gewebe ähnelt61. Die Gesamtdicke der hergestellten Probe betrug etwa 1500 µm und die Dicke des eingeführten Ultraschallgels betrug etwa 330 µm. In ähnlicher Weise haben wir eine mehrschichtige Phantomprobe mit komplexen Netzwerken entwickelt, um komplexe Netzwerkstrukturen in biologischen Geweben nachzuahmen, wie in Abb. 7b dargestellt. Anstelle des Ultraschallgels wurden mehrschichtige Linsengewebe mit einer Gesamtdicke von ~ 300 µm und destilliertes Wasser verwendet, die Gesamtdicke der Probe betrug ~ 1470 µm. Bei beiden Proben wurde ein schnell abbindendes Epoxidharz verwendet, um den Bereich um das Deckglas herum abzudichten und so die Verdunstung von Wasser zu verhindern. Die Probe wurde mit einem Deckglas montiert, das auf das MPM-Objektiv ausgerichtet war, während der Glasobjektträger auf das OCM ausgerichtet war, wie in Abb. 7a, b gezeigt. Um die Nützlichkeit der PD-PT-OCM-Führung für ROIs in einer großvolumigen biologischen Probe für die MPM-Bildgebung zu demonstrieren, wurde eine biologische Probe (Ixodes dammini (Hirschzecke) weiblich, wm-Mikroskopobjektträger, Carolina Biological Supply, NC, USA) eingebettet in a Es wurde ein Objektträger mit einer Länge und Breite von 3 mm (mit Ausnahme einiger Teile der Beine) verwendet. Um die photothermischen PD-PT-OCM-Reaktionen der Phantomproben und der biologischen Probe zu erhalten, wurde die anfängliche Fokusposition des MPM-Objektivs 30 µm unter dem Deckglas platziert und die MPM-Objektivlinse in Schritten von 10 µm-Schritten axial auf die Probe zu bewegt , wie in Abb. 7c dargestellt. Bei jeder Bewegung des MPM-Objektivs wurde der mechanische Verschluss so eingestellt, dass er sich für die gewünschte Zeitspanne (350 ms, sofern nicht anders angegeben) für jede PD-PT-OCM-Signalerfassung öffnete. Die Beobachtungspunkte des OCM, an denen die photothermischen Reaktionen gemessen wurden, wurden aus den Punkten innerhalb des ROI ausgewählt, die das entsprechende photothermische Signal lieferten. Grundsätzlich handelt es sich bei dem hier angegebenen Schrittabstand nicht um einen unbedingt einzuhaltenden absoluten Wert. Beispielsweise wurde ein Schrittintervall von 20 µm verwendet, um die photothermische Reaktion der in Abb. 5 dargestellten biologischen Probe (weibliches Ixodes dammini) zu erzeugen. Das Schrittintervall und die Gesamtwerte können adaptiv basierend auf der Zusammensetzung und Dicke der Probe ausgewählt werden.

Schematische Darstellung von Phantomproben und des PD-PT-OCM-Versuchsprotokolls. (a) ist die schematische Querschnittsdarstellung der einfachen Phantomprobe, die mit Ultraschallgel hergestellt wurde. (b) ist eine schematische Querschnittsdarstellung der komplexen Netzwerk-Phantomprobe, die aus mehrschichtigem Linsengewebe hergestellt wurde. c ist die bildliche Darstellung der MPM-Objektivpositionierung für die PD-PT-OCM-basierte Methodik. Figuren nicht maßstabsgetreu.

Alle notwendigen Daten, die zur Analyse und Reproduktion der im Manuskript präsentierten Ergebnisse und Schlussfolgerungen erforderlich sind, werden in den entsprechenden Abschnitten des Manuskripts bereitgestellt. Weitere Einzelheiten und Daten zu dieser Studie sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde vom Korea Basic Science Institute [Fördernummer D300300 und C330210] und dem von der koreanischen Regierung finanzierten Institute of Information & Communications Technology Planning & Evaluation (IITP) [Nr. 1711152793].

Zentrum für wissenschaftliche Instrumentierung, Korea Basic Science Institute, 169-148 Gwahak-ro Yuseong-gu, Daejeon, 34133, Republik Korea

Naresh Kumar Ravichandran, Hwan Hur, Hyemi Kim, Sangwon Hyun, Ji Yong Bae, Dong Uk Kim, I Jong Kim, Ki-Hwan Nam, Ki Soo Chang und Kye-Sung Lee

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KSL entwickelte das Designkonzept und war Mitentwickler des Bildgebungssystems. RNK hat das System mitentwickelt, Experimente durchgeführt und Daten verarbeitet. RNK hat den Manuskriptentwurf verfasst. KSL und KSC haben das Manuskript kritisch überarbeitet. HK hat die Biochip-Probe hergestellt, die in den Zusatzinformationen verwendet wird. Alle Autoren waren an den Diskussionen beteiligt und trugen zur Ausarbeitung und Überarbeitung des Manuskripts bei.

Korrespondenz mit Ki Soo Chang oder Kye-Sung Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Ravichandran, NK, Hur, H., Kim, H. et al. Markierungsfreie photothermische optische Kohärenzmikroskopie zur Lokalisierung gewünschter Regionen von Interesse bei der Multiphotonen-Bildgebung volumetrischer Proben. Sci Rep 13, 3625 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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Eingegangen: 27. Oktober 2022

Angenommen: 24. Februar 2023

Veröffentlicht: 3. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30524-z

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